Guida completa alla "stanza cellule", cosa aspettarci. Colture cellulari: materiali e metodi

🔬Nell'intricato mondo delle colture cellulari le aree di lavoro in laboratorio sono ben definite in base alle esigenze, infatti, il laboratorio di coltura cellulare può essere suddiviso in diverse aree per eliminare possibilità di contaminazioni ed errori umani, come illustrato nell'articolo precedente. Tuttavia, ci sono alcune aree comuni, come le aree di preparazione, di coltura, di stoccaggio, sterilizzazione, aree di analisi e le aree di quarantena. Scopriamo insieme cosa aspettarci in una stanza cellule dalle strumentazioni ai metodi utilizzati!

Organizzazione: gli ambienti e le stanze

Aree di preparazione: Guanti, camice pulito e si parte!

Ricorda sempre, le cose più importanti sono un quaderno ed una penna! L'organizzazione parte da te, inizia con scrivere la data e gli obiettivi giornalieri, il protocollo da effettuare in giornata ed annota ogni step, in caso di errore, avrai tutto sotto controllo!

Fase 1: Organizzazione, si preparano i materiali (plasticheria, pipette, piastre..) e i reagenti per le colture cellulari. Queste zone devono essere ben illuminate, pulite e decontaminate, fai un check sul quaderno prima di passare alla prossima stanza per verificare di aver preso tutto.

Fase 2: Ok, hai scritto il protocollo ma non sai dove trovare l'essenziale?         Ogni laboratorio ha un area di stoccaggio/magazzino: Queste sono le aree in cui vengono conservati i materiali di coltura, come i mezzi di coltura, i sieri, gli antibiotici. In base alle condizioni di lavoro, spesso sono stanze refrigerate.

Fase 3: L'ingresso in stanza cellule presenta una tappa intermedia;                   le aree di quarantena: queste sono le aree in cui si mantengono le linee cellulari infette o da testare per la presenza di micoplasma. Queste aree devono essere separate dalle altre aree e devono essere dotate di incubatori e cappe di sicurezza biologica, spesso troverai anche dei "bagnetti ad acqua" ovvero piccole vasche che permettono la regolazione della temperatura di acqua distillata e tenerla costante, serve per sciogliere eventuali sieri oppure per iniziare una prima fase di coltura a temperature precise.

Fase 4: Ingresso in stanze cellule una volta appurata l'assenza di micoplasma. In questi ambiente si lavora e coltivano le cellule. Sono generalmente costituite da incubatori, cappe di sicurezza biologica di solito a flusso laminare, sgabelli da lavoro, microscopi e altre attrezzature necessarie per la coltura di cellule.

Cosa è un incubatore?

Gli incubatori sono apparecchiature utilizzate nei laboratori per la coltura di cellule e tessuti cellulari. Essi sono progettati per fornire un ambiente controllato e stabile in cui le cellule possono crescere e moltiplicarsi.

Sono solitamente costituiti da una camera interna, in cui sono collocate le piastre o i flaconi di coltura (flask), un sistema di controllo della temperatura, dell'umidità e della concentrazione di CO2. La maggior parte degli incubatori mantengono una temperatura di 37°C costante e una concentrazione di CO2 del 5%.

La regolazione della temperatura è necessaria per garantire una crescita ottimale delle cellule, mentre il controllo dell'umidità serve per prevenire la disidratazione delle cellule. La presenza di CO2, invece, è essenziale per mantenere il pH del mezzo di coltura e per garantire una corretta diffusione di nutrienti e gas.

Gli incubatori possono essere dotati anche di altre caratteristiche, come un sistema di lampade UV per la disinfezione, un sistema di allarme per segnalare eventuali malfunzionamenti e un sistema di registrazione dei dati di temperatura e di CO2.

La conservazione, i frigoriferi scientifici:

Per la conservazione delle cellule e dei tessuti cellulari, vengono utilizzati generalmente dei frigoriferi specifici per applicazioni scientifiche.

Questi frigoriferi sono progettati per offrire una temperatura costante e stabile, necessaria per la conservazione. In particolare, vengono utilizzati frigoriferi a compressore o a termoelettricità, in grado di mantenere temperature tra i 2°C e i 8°C.

Inoltre, esistono anche frigoriferi a bassa temperatura, che possono essere utilizzati per la conservazione di campioni a temperature inferiori a -20°C o anche fino a -80°C. Questi frigoriferi sono essenziali per la conservazione a lungo termine delle cellule, in particolare per quelle colture che richiedono di essere congelate per la conservazione.

La cappa a flusso laminare:

Una cappa a flusso laminare è un dispositivo utilizzato nei laboratori per proteggere le persone, l'ambiente e gli esperimenti biologici/chimici da particelle e contaminanti presenti nell'aria.

La cappa è costituita da una struttura di metallo che contiene un sistema di ventilazione che crea un flusso d'aria controllato, chiamato flusso laminare, che scorre in modo uniforme e costante attraverso la cappa. Questo flusso d'aria, che può essere orizzontale o verticale, evita la contaminazione dell'ambiente esterno e protegge gli esperimenti all'interno della cappa.

In particolare, il flusso laminare viene generato da un ventilatore posto all'interno della cappa, che aspira l'aria dall'ambiente circostante attraverso un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air), che trattiene le particelle e i contaminanti. L'aria così purificata viene poi fatta passare attraverso una serie di baffle (paratie), che la dirigono in modo uniforme sulla superficie di lavoro della cappa, creando un flusso d'aria laminare.

La cappa a flusso laminare viene utilizzata soprattutto per la manipolazione di sostanze biologiche o chimiche che richiedono un ambiente sterile o che possono essere dannose per l'operatore o l'ambiente circostante. Tra gli utilizzi comuni della cappa a flusso laminare troviamo la coltivazione di cellule e tessuti.

Ora sai cosa aspettarti in stanza cellule ma come analizzare le cellule?

Aree di analisi: Queste sono le aree in cui si analizzano le cellule e i tessuti. Possono essere dotate di microscopi, computer e altri strumenti di analisi.

Ecco alcuni esempi di microscopi:

Microscopio ottico: è uno strumento che utilizza luce visibile per ingrandire e visualizzare campioni di cellule o tessuti. é composto da diverse parti, tra cui una sorgente di luce, un sistema di lenti, un condensatore e un sistema di rilevamento. La sorgente di luce illumina il campione e la luce attraversa una serie di lenti per ingrandire l'immagine. Il condensatore regola la quantità di luce che passa attraverso il campione e il sistema di rilevamento raccoglie la luce riflessa o trasmessa dal campione per creare l'immagine.

Questo tipo di microscopio può essere utilizzato per osservare le cellule in coltura, analizzare le cellule ematiche e studiare la morfologia dei tessuti. Nella stanza cellule di un laboratorio di biologia cellulare possono essere utilizzati diversi tipi di microscopi a seconda delle necessità dell'esperimento.

Esistono diversi tipi di microscopi ottici, tra cui il microscopio a campo chiaro, il microscopio a contrasto di fase e il microscopio a campo scuro.

Microscopio a fluorescenza: questo tipo di microscopio utilizza la luce fluorescente per evidenziare specifiche proteine o strutture cellulari. La luce viene emessa dalle molecole fluorescenti presenti nel campione, che vengono attivate da una sorgente di luce di una certa lunghezza d'onda.

Microscopio confocale: è un tipo di microscopio a fluorescenza che consente di ottenere immagini tridimensionali di campioni cellulari. Questo strumento utilizza un sistema di scansione laser per illuminare i campioni e uno speciale sistema di rilevazione per ottenere immagini ad alta risoluzione.

Microscopio elettronico a scansione (SEM): è uno strumento che utilizza un fascio di elettroni per ottenere immagini ad alta risoluzione della superficie delle cellule. Questo tipo di microscopio è utile per studiare la morfologia e la struttura delle cellule e dei tessuti.

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM): utilizza un fascio di elettroni per visualizzare immagini a livello subcellulare. Questo tipo di microscopio permette di visualizzare la struttura interna delle cellule e dei tessuti ad alta risoluzione.

Come si contano le cellule?

La conta delle cellule al microscopio ottico è un metodo manuale effettuato tramite l'utilizzo di un'apposita camera di conteggio, chiamata camera di Neubauer o ematocitometro, che consiste in una piccola griglia rettangolare suddivisa in quadranti.

Per effettuare la conta delle cellule, si preleva un piccolo campione di sospensione cellulare e si lo si diluisce con un opportuno volume di liquido (solitamente il mezzo di coltura) in modo da avere una densità cellulare che consente di distinguere facilmente le singole cellule al microscopio per poi contarle nei singoli quadranti o aree totali.

La camera di Neubauer può essere utilizzata sia per la conta di cellule ematiche (come i globuli rossi e i globuli bianchi) che per la conta di altri tipi cellulari. Tuttavia, è un metodo manuale e quindi soggetto ad errori di lettura, per cui sono stati sviluppati metodi automatizzati.

Hai finito l'esperimento? Ricordati di pulire!

Ebbene si, la cross-contaminazione in ambito cellulare rischia di far gettare mesi di lavoro, tieni sempre pulito, sia la cappa che strumenti, tutte le postazioni di lavoro!

Una volta terminato il lavoro puoi recarti in un area di sterilizzazione: Queste sono le aree in cui si sterilizzano gli strumenti e i materiali utilizzati nelle colture cellulari, è importante autoclavare il materiale da utilizzare e successivamente, sterilizzare i strumenti di lavoro.

Queste zone, generalmente, sono dotate di autoclavi e di altri strumenti di sterilizzazione.

OK, guida finita, adesso siete pronti ed operativi per un buon lavoro!

                        Autore: Umberto Lazzaro

Fonti:

• Guidelines for the use of cell lines in biomedical research - British Journal of Cancer
• Cell Culture Basics Handbook -  Thermo Fisher Scientific
• Microbial Contamination Control in Pharmaceutical Clean Rooms - PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology